撰文
章台柳
#先天性肌无力#
先天性肌无力（CM）是由于基因突变导致的一组疾病，这些基因对于神经肌肉突触的形成、功能和维持等非常重要。基因突变会降低基因的活性，导致突触缺陷，从而导致神经肌肉突触的早发性结构和功能缺陷，这就是患者终生肌无力的原因。
神经肌肉突触的形成和维持需要高度特化的突触前膜和突触后膜的聚集。运动神经末端释放AGRIN，与肌肉上LRP4结合，刺激LRP4与MUSK形成复合物，MUSK是一种受体酪氨酸激酶，是突触分化的的主要调节因子。MUSK激活也可导致LRP4在突触后膜成簇，会直接作用于运动神经的轴突刺激突触前的分化。AGRIN、LRP4和MUSK以及编码乙酰胆碱受体（AChRs）的基因发生突变，会导致CM发生。
MUSK的激活同样依赖于适配器蛋白DOK7，Dok7的突变发生在10-20%的CM患者。CM导致病人四肢、颈部和面部肌肉无力，1/4的DOK7CM患者有时会需要无创通气，且很少有治疗可以减轻临床症状。DOK7的N端包括PH和PTB结构域，介导其自身的二聚化及与MUSK的近膜区（JM）的磷酸化酪氨酸基序的结合。如果DOK7结合MUSK失败，将导致AGRIN刺激MUSK磷酸化失败，说明DOK7对稳定MUSK磷酸化，促进其二聚化，是必需的。此外，AGRIN刺激MUSK磷酸化也导致DOK7的C端上2个酪氨酸残基发生磷酸化，诱导参与AChRs成簇的CRK和CRKL蛋白的招募。Dok7CM的最常见原因是一个四碱基的重复（-，TGCC），导致阅读框的移码，翻译提前终止。有的患者是这种突变的纯合子，有的患者是同时携带另一种突变。截短形式的DOK7保留了PH和PTB结构域，可与酪氨酸磷酸化的MUSK近膜区结合，但缺乏C端的2个酪氨酸残基，无法发生磷酸化并招募CRK蛋白。即缺失这两个酪氨酸残基或许是四碱基重复突变的Dok7CM发生突触缺陷的原因。但目前关于四碱基重复突变Dok7CM的病理机制和治疗策略有待进一步研究。
年6月23日，来自纽约大学格罗斯曼医学院的StevenJ.Burden和ShoheiKoide在Nature杂志发表文章MechanismofdiseaseandtherapeuticrescueofDok7congenitalmyasthenia，构建了四碱基重复突变的Dok7CM小鼠和两个酪氨酸残基突变的Dok72YF小鼠，发现Dok7CM小鼠在神经肌肉突触形成有严重的缺陷，导致新生致死。然而，这种缺陷是由于MUSK磷酸化和激活的严重缺陷导致，而不是DOK7酪氨酸磷酸化的缺陷。MUSK的激活性抗体可以恢复Dok7CM小鼠的神经肌肉突触的形成，预防新生致死以及后期疾病的发生。
为了研究DOK7缺失C端区域如何导致神经肌肉突触的结构和功能出现缺陷，研究人员构建了四碱基重复突变小鼠Dok7CM和两个酪氨酸残基突变的小鼠Dok72YF。E18.5天时，纯合Dok7CM和小鼠的数量还符合预期，但出生时，很少有纯合的小鼠存活，这与神经肌肉突触对呼吸和生存是必需的相一致。观察膈肌，Dok7CM小鼠的突触数量比野生型（WT）少5倍，且形成的突触不成熟，突触的大小和突触上AChRs的密度都减少5倍；但是纯合的Dok72YF小鼠出生数量符合预期，且成年老鼠具有生育能力，神经肌肉突触基本正常。也就是说，DOK7的C端缺失两个酪氨酸残基并不是Dok7CM小鼠致死和严重的突触缺陷的原因。进一步研究发现，Dok7CM小鼠肌肉的Dok7mRNA水平正常，但截短型DOK7蛋白的表达量比WTDOK7低3倍；而Dok72YF小鼠的DOK7蛋白水平正常。因为DOK7作为一个二聚体导致MUSK的二聚化，稳定MUSK的酪氨酸磷酸化，Dok7CM小鼠中MUSK的磷酸化减少了7倍，而Dok72YF小鼠则正常。
之前的研究显示，AGRIN刺激MUSK磷酸化也导致DOK7的C端上2个酪氨酸残基发生磷酸化，进而招募CRK和CRKL蛋白。检测发现，Dok7CM小鼠中CRK招募到突触和到MUSK复合物显著降低，约2.8倍；但Dok72YF小鼠略微下降，仅减少28%。同时发现CRK和DOK7都可与MUSK的JM位点结合，依赖于磷酸化，突变SH2结合基序则抑制CRK的结合。即CRK不仅能结合于磷酸化的DOK7C端，而且可直接结合酪氨酸磷酸化的MUSKJM区域。
如果抑制MUSK的磷酸化导致Dok7CM，那么刺激MUSK或可挽救突触缺陷，克服致死性。研究人员构建出高亲和力抗体X17，结合人和小鼠的MUSK，不依赖于AGRIN即可激活MUSK的磷酸化。腹腔注射小鼠，发现X17在血液中的半衰期是5天，长期注射超过两个月，未发现严重副作用。Dok7CM小鼠注射X17可逆转体重降低和早期致死性，且效果可持续数周；长期注射X17可延长Dok7CM小鼠生存期至少两个月。X17促进突触形成和成熟，恢复CRK蛋白招募到神经肌肉突触，X17抗体还挽救Dok7CM小鼠的运动功能，同时接受X17治疗的Dok7CM小鼠具有生育能力，后代正常。如果在成年期中断X17的治疗，Dok7CM小鼠在2-3个月内继续维持体重和运动能力，说明抗体的效果比其在血液中存在的时间要长。然而，小鼠最终会体重下降，运动出现障碍。当体重开始下降时给予X17治疗，2天后小鼠体重出现回升，1周内运动能力恢复。
总的来说，研究首先明确Dok7CM的致病机制与其C端的2个酪氨酸残基的缺失或失活突变无关，与MUSK的磷酸化缺陷有关，同时研制出MUSK的激活性抗体，证明其具有治疗Dok7CM小鼠的潜力，或是治疗Dok7CM的新靶点。
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